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PCR常見(jiàn)問(wèn)題

點(diǎn)擊次數:6324   發(fā)布時(shí)間:2021/11/9 21:44:02

                                                                         PCR常見(jiàn)問(wèn)題
                                                               圣賓儀器科技上海有限公司
問(wèn)題1:假陰性(無(wú)擴增產(chǎn)物)
現象:正對照有條帶,樣品無(wú)條帶
可能原因:
模板:含有Taq酶抑制劑、雜蛋白,模板上樣量低或模板降解
引物:引物降解,引物設計不合理
試劑:酶失活,buffer不合適
反應條件:退火溫度高,延伸時(shí)間短
解決方法:
純化模板并重新提取,并檢測模板是否含有抑制劑
重新設計引物并低溫保存
優(yōu)化buffer,摸索鎂離子濃度或適當加入DMSO(小于0.3%)
降低退火溫度,增加延伸時(shí)間(反應條件參照試劑盒說(shuō)明書(shū))
問(wèn)題2:假陽(yáng)性
現象:空白對照出現條帶
可能原因:
引物設計不適,與目的序列具有同源性
試劑污染:水、移液槍等被核酸污染
樣品間出現交叉污染
解決方法:
實(shí)驗儀器高壓滅菌
實(shí)驗試劑(酶除外)高壓滅菌,離心管槍頭一次性使用
規范實(shí)驗操作
假陽(yáng)性可通過(guò)巢式PCR解決,或者使用特異性較高的試劑盒擴增
問(wèn)題3:拖尾、彌散
現象:電泳出現拖尾、涂抹帶
可能原因:
酶用量過(guò)多
模板純度較低
dNTP、鎂離子濃度過(guò)高
循環(huán)次數過(guò)多
解決方法:
減少用酶量或使用特異性高的熱啟動(dòng)酶擴增
純化模板
減少dNTP用量,摸索鎂離子濃度
減少循環(huán)次數
問(wèn)題4:二聚體及非特異性產(chǎn)物
一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體
主要原因:
引物設計不合理,引物自身具有互補性
引物濃度不適
鎂離子濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低
解決方法:
重新設計引物并進(jìn)行BLAST檢測
降低鎂離子濃度,提高退火溫度
增加模板用量
提高PCR反應特異性的方法
引物的設計
引物在模板cDNA的保守區設計,長(cháng)度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超過(guò)連續三個(gè)G或C,堿基分布錯落有致,避免引物自身形成二聚體,設計完成之后,需進(jìn)行BLAST檢測,如果與其他基因不具有互補性,則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗。
降落PCR
降落PCR是一種簡(jiǎn)單的降低非特異性產(chǎn)物的PCR的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗耗時(shí),同時(shí)又可以?xún)?yōu)化實(shí)驗的步驟。引物的設計決定退火溫度,退火溫度過(guò)高會(huì )使PCR效率過(guò)低,過(guò)低則會(huì )使非特異擴增過(guò)多。這雖然可以通過(guò)反復嘗試來(lái)優(yōu)化,但費時(shí)費力。降落PCR提供了一個(gè)較為簡(jiǎn)易的優(yōu)化方法。先在較高的溫度下擴增,此時(shí)雖然擴增效率低,但非特異擴增基本沒(méi)有。隨著(zhù)退火溫度的降低,非特異擴增會(huì )逐步增多。但由于此時(shí)特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數量?jì)?yōu)勢,因此會(huì )對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制,從而大幅提高PCR的特異性和效率。
熱啟動(dòng)擴增
采用熱啟動(dòng)方法進(jìn)行擴增,是除了設計引物之外,提高PCR反應特異性的方式。在一般的PCR反應中,試劑的配置需在冰上進(jìn)行,且要將PCR儀預熱,這種方法就類(lèi)似于熱啟動(dòng),能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性,只要體系中有DNA鏈存在,就會(huì )擴增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動(dòng)的方法就是在達到變性溫度之抑制酶的活性,而有效的方法就是使用熱啟動(dòng)酶或高保真酶去擴增,它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心,當溫度上升到95℃時(shí)恢復活性,指導擴增。
巢式PCR
采用巢式PCR進(jìn)行擴增,在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是,它采用兩對引物進(jìn)行擴增,先用對引物普通PCR,然后將輪擴增的產(chǎn)物稀釋100倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
                                                                                                                                                            本篇轉載至實(shí)驗之家

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